Il film si apre con la nascita di una bambina: Riley. Al contempo nella mente della piccola compare un'emozione: Gioia. All'inizio sembra che ci saranno solo loro due, "...ma questo durò solo per 33 secondi" dice Gioia. Infatti, nella mente della bambina, è nata un'altra emozione: Tristezza. Con il passare del tempo, la mente di Riley si affolla sempre di più fino ad arrivare a cinque emozioni: Gioia, Tristezza, Disgusto, Rabbia e Paura. Tutti e cinque si occupano di compiti ben specifici: Gioia garantisce la felicità di Riley ed è la sua emozione dominante, Paura ha il compito di mantenere Riley al sicuro, Rabbia garantisce la giustizia della bambina, Disgusto evita che Riley venga avvelenata fisicamente e socialmente, mentre nessuna emozione, in particolar modo Gioia, riesce a capire quale sia lo scopo di Tristezza. Inoltre, si scopre di più sull'organizzazione della mente: ogni ricordo (racchiuso in una sfera del colore dell'emozione associata) viene prima archiviato nel Quartier Generale, per poi essere trasferito a fine giornata nella Memoria a Lungo Termine (un labirinto di scaffalature che si estende attorno al Quartiere e le varie zone della mente). Alcuni Ricordi, i fondamentali per la personalità dell'individuo, vengono archiviati in un nucleo nel Quartiere Generale e costituiscono i Ricordi Base. Ad ogni Ricordo Base è associata un'Isola della Personalità (che si crea attorno al Quartier Generale e si anima ogni volta che l'individuo compie un'azione emotiva legata ad essa), e le Isole, personali per ognuno, rendono ogni persona unica. Ogni volta che serve, le Emozioni possono richiamare un ricordo dalla Memoria, letteralmente proiettando il contenuto della sfera sul monitor della sala di controllo. Esistono poi le Idee, lampadine (di forma diversa a seconda del tipo di idea necessaria) che le Emozioni collegano al pannello di controllo per attivarle.

D'un tratto la famiglia di Riley è costretta a trasferirsi dal Minnesota a San Francisco a causa del lavoro del padre e Riley non può fare a meno di essere delusa nel vedere la nuova casa, anche se Gioia tenta comunque di mantenere alto il buon umore della ragazza: proietta un ricordo gioioso, ma Tristezza, toccandolo, lo modifica rendendolo triste. Nessuna Emozione capisce come Tristezza ci sia riuscita e nonostante i tentativi Gioia non riesce a sistemarlo. Il primo giorno di scuola, Riley viene invitata a presentarsi alla classe e quando l'insegnante le chiede del Minnesota, Gioia, Paura, Disgusto, Rabbia e Tristezza le fanno ricordare i momenti in cui giocava a hockey o quando pattinava sul lago ghiacciato. Tristezza tocca il ricordo gioioso della ragazza e lo modifica: Riley si lascia prendere dalla malinconia e inizia a piangere davanti alla nuova classe. Immediatamente al Quartier Generale arriva un Ricordo Base di colore blu, triste. Gioia non vuole che quel Ricordo Base finisca con gli altri e tentando di impedire alla sfera di inserirsi nella postazione, rovescia gli altri Ricordi Base e attiva il tubo aspirante che permette lo scambio dei ricordi tra il Quartier Generale e la Memoria. Tentando quindi di recuperare i ricordi, lei e Tristezza vengono risucchiate con i Ricordi Base.
Senza più Ricordi Base nella postazione, le Isole delle Personalità si spengono, diventando grigie e inerti. Riley rimane vittima della Rabbia, del Disgusto e della Paura, che provano a mantenere lo stato emotivo della ragazzina, cercando inutilmente di impersonare Gioia. Ciò causa però il crollo delle Isole della Personalità del divertimento, dell'Hockey (passione della ragazza) e dell'Amicizia nel Baratro della Memoria, un abisso dove ricordi dimenticati vengono gettati e lentamente e completamente eliminati dalla mente. Nel frattempo, Gioia e Tristezza sono catapultate nella Memoria a Lungo Termine, un archivio labirintico e infinito di scaffali colmi di ricordi, cercando una strada per il ritorno. Fra gli scaffali incontrano Bing Bong, buffo essere, amico immaginario di una giovane Riley, con cui tentano di raggiungere il Treno dei Pensieri per arrivare al Quartiere Generale. Passano così attraverso il pericoloso Pensiero Astratto e Immagilandia (dove l'immaginazione di Riley si realizza) e durante il tragitto Gioia comincia a capire quale sia il compito di Tristezza. Saliti sul Treno però Riley va a dormire e, sapendo che il loro mezzo di trasporto non si muoverà fino a che Riley non sarà sveglia, decidono di fare un salto alla Cineproduzione Sogni (dove i sogni, come in uno studio cinematografico, vengono ripresi e trasmessi) dove cercheranno di svegliare Riley con un incubo. La loro bravata però non produce gli effetti sortiti e Bing Bong viene rinchiuso dalla sicurezza nel Subconscio (un'oscura zona chiusa dove ogni paura inconscia è rinchiusa); toccherà a Gioia e Tristezza tirarlo fuori da li sfruttando le paure più recondite e nascoste di Riley.